SC∕T 7226-2017 鲑甲病毒感染诊断规程(水产)
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ID： |
66110288EA44443AB871229DABAFED8F |
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文件大小(MB)： |
0.73 |
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页数： |
13 |
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文件格式： |
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日期： |
2021-12-24 |
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ICS 65.020.30,B 41,卡:才H,中华人民共和国水产行业标准,SC/T 7226-2017,蛙甲病毒感染诊断规程,Diagnostic protocol for salmonid alphavirt四,2017 - 06 - 12 发布2017 - 10 - 01 实施,中华人民共和国农业部发布,SC/T 7226-2017,a.L.. ~,目。吕,本标准按照GB/ T 1. 1-2009 给出的规则起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任,本标准由农业部渔业渔政管理局提出,本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/ TC 156) 归口,本标准起草单位: 东北农业大学、全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出入境检,验检疫局,本标准主要起草人:刘敏、余卫忠、吕永辉、江育林、张利峰、任彤,I,SCj T 7226-2017,蛙甲病毒感染诊断规程,范围,本标准给出了蛙甲病毒感染的临床症状检查，规定了样品采集及处理、病毒分离、病毒鉴定及结果,的综合判定的方法,本标准适用于蛙甲病毒,监测,2 规范性引用文件,下列文件对,件。凡是不注日,GBj T 6682,GB/ T 1,SC/ T 71,3 缩略语,下列缩,CHSE,CPE:,4,DEPC:,dNTP:,FCS:,RT-PCR,SAV: 蛙,4. 1 水:应符合,4.2 SAV 参考株:由,4. 3 CHSE - 214 细胞,4.4 Trizol 试剂， 4 'C 保存,4.5 M-MLV 反转录酶(200U) ，一20,4.6 DNA 分子量标准: DL2000 ,4. 7 澳化乙链,4.8 琼脂糖:电泳级,4.9 dNTP: 10 mmo l/ L ，一20'C 保存,4. 10 Taq DNA 聚合酶:5 U/ μL ，一20'C保存,4. 11 RNA 酶抑制剂(40 U/ μ L)， 一20'C保存,4. 12 TBE 电泳缓冲液(5 倍浓缩液) :配方按附录A 中A. 1 的规定执行,4. 13 引物:用TE 缓冲液或无菌去离子水配置成10μmo l/L， - 20'C 保存;扩增大小为516 忡。引物序,SC/T 7226-2017,列如下:,E2F: 5'- CCG - TTG - CGG - CCA - CAC - TGG - ATG - 3',E2R, 5'- CCT - CAT - AGG - TGA - TCG - ACG - GCA - G - 3',4. 14 磷酸盐缓冲液CPB曰:0. 0 1 mol/ L ，配方按附录A. 2 的规定执行,4. 15 L … 1 5 或EMEM 细胞培养液,4. 16 胎牛血清,4. 17 元水乙醇:分析纯,4. 18 普通琼脂糖凝胶DNA 电泳6 倍上样缓冲液,5 仪器和设备,5. 1 高速冷冻离心机:4.C 转速12000 g 以上,5.2 - 2 0 .C 冰箱,5.3 PCR 仪,5. 4 核酸电泳仪和水平电泳槽:输出直流电压o V~600 V,5. 5 凝胶成像仪,5. 6 可控温水浴锅或恒温金属浴,5. 7 微波炉,5. 8 生化培养箱,5. 9 涡旋振荡器,5 . 10 超净台,5. 11 组织匀浆器,5.12 倒置显微镜,6 流行情况与主要临床症状,参见附录B ,7 采样,7. 1 采样对象,蛙、蹲等易感鱼类,7. 2 采样水温与数量,应在水温低于18.C 进行，采样数量应符合SC/ T 7103 的要求,7.3 样品采集,在渔场收集患病的、死亡的、体弱的和行为不正常的，特别是在网箱底部昏睡不动的鱼;采集心脏、,跑、膜腺和骨髓肌。对有临床症状的鱼，体长< 4cm 的鱼苗取整条，带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊;体长,4 cm~ 6 cm 的鱼苗取所有内脏;体长> 6 cm 的鱼取心脏、膜脏、m恩和骨髓肌。对元症状的鱼取心脏、膜,脏和骨髓肌。取样数量按GB/ T 18088 的规定执行,8 病毒分离和鉴定,8. 1 病毒分离培养,8. 1. 1 样晶处理,SAV 的分离，每5 尾鱼为1 个样品，若有症状成鱼每1 尾为1 个样品。先用组织匀浆器将样品匀,2,SC/T 7226-2017,浆成糊状。再按1 : 10 的最终稀释度重悬于L - 15 或EMEM 培养液中。将样品匀浆后再悬浮于含有,1000IU/ mL 青霉素和1000μg/ mL 链霉素的培养液中，于15.C 下孵育2 h ~4 h 或4.C 下孵育6h~,24 h. 7000 g 离心30min ，收集上清液。如果鱼样本来自于确诊感染传染性膜脏坏死病毒的渔场，应先,用传染性膜脏坏死病毒的抗血清在15.C 孵育样品至少1 h ,8. 1.2 病毒分离,8. 1. 2. 1 样品接种细胞与培养观察,将CHSE - 214 细胞传到96 孔板， 于20.C 培养。把1 : 10 稀释过的样品再用培养液10 倍稀释成,1 : 100 和1 : 1000 ，然后把这三个稀释度也群具些白吐土豆48 h 内的长满细胞单层的96 孔板中。每,个样品至少接种2 孔，每孔的细胞县揭砸酶噜嚼翩嗣跚跚醺篱囔画M立附2 h~ 3 h 后除去接种物，加入含,2%~5%胎牛血清的L - 15 事垂费4带在弘主地刷品回时设置2 个阳性对照(接种,SAV 参考株)和2 个空白温画腿脚加明划。B间刑唰矗扯l置显微镜观察，连续观察,至少7d。如果接种了到_r-<':.t~撞事鞭幽幽盏益汇丰邑N嫫!跚…a'E) ，应立即进行鉴定,CPE 表现为致密的姐， 协绍醺跚……
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